In Kitzingen gibt es seit dem Jahr 1250 eine christliche Gemeinde. Auf den Platz wo sich heute die Stadtkirche befindet stand einst das Benediktinerinnen-Kloster welches von Bonifatius gegründet wurde. Die Evangelische Stadtkirche Kitzingen wurde in den Jahren 1685 bis 1693 von Antonio Petrini als Klosterkirche für das damalige Ursulinenkloster erbaut. Die erste evangelische Predigt fand am 8. August 1522 statt. Im Jahr 1809 wurde das Kloster säkularisiert und die Klosterkirche profaniert. 1817 kaufte die evangelische Gemeinde von Kitzingen, die sich zuvor im Vorort Etwashausen angesiedelt hatte, das Kirchengebäude, das seitdem den Mittelpunkt des evangelischen Gemeindelebens von Kitzingen bildet. Mit ihrem 65 Meter hohen Turm prägt die Kirche das Stadtbild von Kitzingen. Das Kircheninnere wurde mehrfach umgestaltet und renoviert und zeigt sich heute mit einem weiten, schlicht gehaltenen Innenraum. Auf der Nordseite des Kirchenschiffs befindet sich eine Doppelempore. Die Decke des Kirchenschiffs ist mit Stuck verziert. Im Jahr 1698 erbaute Johann Hoffmann die erste Orgel für die Evangelische Stadtkirche. Dieses Instrument wurde im Zuge der Säkularisation an die Kirchengemeinde St. Stephan in Würzburg verkauft. Die heutige Orgel wurde von der Orgelbaufirma Steinmeyer als "Universalorgel" in den Jahren 1951 bis 1958 in drei Etappen erbaut. Das Taschenladen-Instrument hat 58 Register auf drei Manualen und Pedal. Die Trakturen sind elektropneumatisch. Eine Besonderheit ist das in zwei Teilwerke aufgeteilte Oberwerk. Die Stadtkirche ist jeden Tag geöffnet. So hat jede und jeder in der Stadtkirche Gelegenheit zu Besinnung und Gebet.